pcr 검사 원리

중합효소 연쇄 반응

polymerase chain reaction (PCR)

 

DNA의 원하는 부분을 복제, 증폭 시키는 분자생물학적 기술

이 기술은 매우 복잡하며 양이 작은 DNA용액에서 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭한다.

 

사용 범위

질병 진단, 분자 생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류등 DNA가 괸련된 작업 전반에서 중요한 역할을 한다

 

 

검사시 필요한 것

• 복제할 DNA
• 프라이머: DNA 복제가 시작되는 지점을 제공한다.
• DNA 중합효소(Taq): 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 과정에서 가열과 냉각이 반복되기 때문에 열에 변성이 일어나지 않아야 한다.
• DNA 중합효소용 완충용액: 효소가 활성을 얻는 데 필요한 것들이 들어있다.
• dNTP:DNA 합성 될때 재료로 이용되는 3개의 인산이 결합된 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 합성에 필요한 4가지 염기의 뉴클레오 타이드를 모두 제공해야 되어야 함으로dATP,dTTP,dGTP,dCTP 모두 필요로 한다

 

원리

복제에 필요한 효소만 뽑아서 DNA와 프라이머를 섞어주면 스스로 복제를 하도록 함

 

과정

 

 

DNA의 변성 (Denaturation)

92 °C ~ 95 °C로 가열하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리시킨다. 높은 온도일수록 단일가닥 DNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA 중합효소도 온도가 아주 높은 상태에서는 변성되어 사용하지 못하게 될 수 있으므로 보통 94 °C로 한다.

프라이머의 결합 (Annealing)

50 °C ~ 65 °C에서 진행된다. 프라이머가 자신의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖고 있는 DNA에 결합하는 단계이다. 염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G-C 결합이 A-T결합보다 강하다. 따라서 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것이 좋다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 프라이머 쌍을 이용하는 것이 바람직하다. 보통 30초가량 지속되는데 이 단계에서 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작된다.

DNA의 신장 (Elongation)

 

70 °C ~ 74 °C에서 시행하며 원하는 PCR산물의 크기가 크거나 반응효소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq 중합효소는 보통 1분에 2,000-4,000 염기쌍을 중합할 수 있으므로 원하는 PCR산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋다.

이 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 20∼40회) DNA의 원하는 부분을 증폭시키는 것이 PCR 의 원리이다.

원하는 부분을 제대로 증폭시켰는지 확인하기 위해서 PCR산물의 크기를 비교할 수 있는 아가로스겔전기영동을 이용하는 것이 일반적이다. PCR산물의 크기는 DNA ladder라 불리는 것과의 비교를 통해 대략적으로 알 수 있다.